Un 14 de julio de 1771 Fray Junípero Serra fundó la Misión de San Antonio de Padua en el valle de los Robles para así establecer la tercera misión española en California. Según la tradición popular el inicio de la misión fue muy rudimentario ya que Fray Junípero Serra, acompañado de los padres Miguel Pieras y Buenaventura Sitjar, colgó las campanas en las ramas de un roble y llamaron a esta misión San Antonio de Padua. Pronto Serra partió, dejando encargados a Pieras y Sitjar para que junto con un pequeño grupo iniciaran la Misión.
En 1773 la Misión fue trasladada de su ubicación original a un lugar más al norte en el valle de Los Robles debido a la inestabilidad de la fuente de agua. A finales de 1773 la Misión estableció talleres, una pequeña iglesia y viviendas en la nueva ubicación. Se estima que en esa época ya habitaban en ella unas 163 personas entre conversos y soldados. Este año marcó además un hito histórico, ya que en esta misión tuvo lugar el primer matrimonio celebrado en Alta California entre Juan María Ruiz y Margaretta de Cortona. En San Antonio de Padua se alojó también el explorador español Juan Bautista de Anza cuya memoria sigue viva en muchos lugares de la costa oeste estadounidense.
En 1810 se inició la tercera y última estructura de la iglesia conocida como la Gran Iglesia. Esta medía 60 metros de largo y 12 metros de ancho, con paredes de adobe de aproximadamente 2 metros de espesor. Finalmente se bendice en el año 1813 y es el mismo edificio de la iglesia que hoy en día podemos visitar aunque tuvo que someterse a reconstrucciones posteriores.
Bajo el dominio mexicano en 1834, la misión pasó a la jurisdicción civil y los terrenos fueron divididos en ranchos y vendidos a particulares aunque en 1863 sería devuelta por el gobierno estadounidense a la Iglesia católica. Se llevó a cabo un proceso de reconstrucción de la misión a principios de siglo XX que por diversos contratiempos no culminó hasta mediados de siglo ya con los los franciscanos administrando de nuevo el terreno.
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